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技术专栏

WB实验之内参选择
供稿:市场部发布时间:2023-06-14浏览量:208次

免疫印迹(Western Blot)在研究蛋白相关实验中是关键技术,由于实验周期较长、步骤繁琐,影响因素较多,在实验过程中经常会遇到各种难题。我们需要追根求源,查找并修复问题。今天我们讲解下WB实验中内参的选择。

什么是内参及内参的作用

内参即是内部参照(Internal control),是指在组织和细胞中表达相对稳定的一类蛋白质,通常由管家基因编码。这些蛋白质被用作检测蛋白表达水平变化时的参照物,以确定实验的准确性和可重复性。

在Western Blot实验中,我们使用内参其实就是使用与内参对应的抗体来检测内参的表达量。由于内参在不同组织和细胞中的表达量相对稳定,通过检测每个样品内参的表达量,我们可以校正上样误差,从而获得更可靠的半定量结果。使用内参还可以作为空白对照,检测蛋白转膜情况是否完全,并检查该实验中的显色或发光体系是否正常。通过选择合适的内参,可以将这些样本之间的差异消除或最小化,减少实验误差,提高结果的可靠性和可重复性。因此,选择合适的内参是Western Blot实验的关键步骤之一。

 

如何选择合适内参

样本种属来源

根据所做的蛋白样本的种属确定,哺乳动物一般β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Na+/K+-ATPase等;植物样本一般选择Plant actin、Rubisco等;其他来源样本应参考文献报道选合适蛋白作为内参。

蛋白表达位置

根据研究对象的不同,选择不同的内参对于检测细胞中不同位置的蛋白非常重要。一般情况下,选择β-actin和GAPDH作为总蛋白的内参就可以满足要求。然而,对于细胞质、细胞核、细胞膜等不同位置的蛋白检测,我们需要选择相应的内参,以确保实验结果具有科学性和可靠性。常用内参抗体分子量及其定位情况如下:

a.胞浆和全细胞蛋白:β-actin(43kDa)、GAPDH(37kDa)、Tubulin(55kDa)等;

b.核蛋白:PCNA(29kDa)、Histone H3(17kDa)、Lamin B (66kDa) 等;

c.胞膜蛋白:Na+/K+-ATPase(100kDa)等;

d.线粒体蛋白:COX IV(17kDa)、VDAC1(30kDa)等。

目的蛋白分子量

在选择内参抗体时应考虑目的蛋白分子量大小,通常要求目的蛋白与内参蛋白分子量相差5kDa以上。例如,若检测的目的蛋白分子量为45kDa,则不宜选择分子量为42kDa的β-actin作为内参,应考虑选择分子量为36kDa的GAPDH作为内参。

实验环境影响

在实际的实验环境中,处理条件可能会影响一些内参的表达,因此需要考虑研究的信号通路是否会对内参的表达产生影响。例如,在糖代谢的研究中,不能使用GAPDH作为内参,因为GAPDH是参与糖酵解过程中的酶,在某些细胞中,缺氧等条件会改变GAPDH的表达;在凋亡实验时,Lamin等也不适合作为内参;在加入抗有丝分裂和抗真菌药物时,Tubulin的表达易受影响,不适合作为内参等。因此,在设计实验方案的时候应考虑这些因素并参考相关文献,在实验过程中,还需要留意内参表达是否出现异常等因素的考虑。

不同的组织特异性

actin 即肌动蛋白,是细胞的一种重要骨架蛋白。actin 大致可分为六种,其中四种是不同肌肉组织特异性的,包括alpha-skeletal muscle actin、alpha-cardiac muscle actin、alpha-smooth muscle actin和gamma-smooth muscle actin,其余两种广泛分布于各种组织中,包括beta-actin(β-non-muscle)和gamma-non-muscle actin。这些不同的亚型组织分布是不一样的,在肌肉组织中beta-actin分布就很少,心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此,不同的组织应选择不同的内参,不能一概而论。

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